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    醫學論文

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    骨代謝相關通路及信號分子的研究進展
    時間:2018-02-16 11:11:51

    骨質疏松是一種以骨量降低和骨脆性增加為特征的骨病,每年世界范圍內有超過9百萬例骨質疏松性骨折。正常情況下骨量維持有賴于骨吸收與骨形成之間平衡的維持,多種因素可打破這一平衡,目前認為年齡相關的骨代謝水平改變及絕經后雌激素水平下降、男性睪酮生成減慢是原發性骨質疏松發生的主要原因。最初抗骨吸收藥阿倫唑奈等進入臨床應用并取得一定療效,但同時也面臨抗骨形成、不能改善骨小梁微結構等問題,隨著對骨代謝相關通路研究的深入,新的更具針對性的藥物如狄諾塞麥、硬化蛋白抗體等已進入臨床試驗。對骨代謝相關通路的研究為骨質疏松的治療提供了更多潛在的靶點。本文就骨代謝相關通路及信號分子展開綜述。

    一、Wnt通路

    Wnt通路包括參與信號轉導的Wnt蛋白,卷曲蛋白(Frz)、低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP),β-連環蛋白,T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF),以及參與通路調控的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、軸蛋白(Axin/Conductin)、腺瘤樣結腸息肉蛋白(APC)、散亂蛋白(DSH)、酪蛋白激酶α。其中卷曲蛋白與LRP5/6形成Wnt蛋白的共受體,GSK-3β、Axin、APC、酪蛋白激酶α組成降解復合體,調節胞內β-catenin水平。

    β-catenin是經典通路中調節成骨分化的關鍵因子,其N端富含絲氨酸、蘇氨酸,為降解復合物結合位點,C端為TCF/LEF結合位點。Wnt/β-catenin通路處于失活狀態時,β-catenin與降解復合物結合,并被GSK-3β磷酸化,進而經泛素化后被降解,使細胞質內β-catenin處于較低水平。當Wnt蛋白與Frizzled蛋白、LRP5/6結合后,DSH可與APC競爭性結合GSK-3β,導致降解聚合物解聚,GSK-3β失活,使β-catenin在細胞質內穩定存在,并向細胞核內轉移,通過其C端與轉錄因子TCF/LEF結合,正性調節Runx /Cbfα轉錄因子家族基因的表達,CBFα1/RUNX2能通過誘導間充質干細胞早期分化及抑制其后期凋亡促進成骨分化,在成骨細胞中CBFα1與骨橋蛋白、骨唾液蛋白、骨鈣素基因、膠原蛋白1a啟動子結合,調控骨發育。

    Wnt非經典途徑包括Wnt-平面細胞極性(PCP)途徑,Wnt-鈣離子途徑,需要鈣離子、cGMP等第二信使參與信號轉導,影響過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、RUNX2、活化T細胞核因子(NFATC1)等關鍵分子的活性。近來,Wnt非經典通路在骨代謝中的作用越來越被重視。Kazuhiro Maeda發現,Wnt5a可以通過酪氨酸激酶孤受體(Ror)激活JNK通路,募集c-jun至核因子κB受體活化因子(RANK)靶基因啟動子,介導破骨細胞分化。而GWAs和動物實驗證實Wnt16Wnt4能通過增加骨保護素(OPG)和抑制κ基因結合核因子(NF-κB)活性發揮骨保護作用。

    硬化蛋白是一種天然的Wnt通路拮抗劑,由SOST基因編碼,在骨組織中高表達,負性調節骨分化過程。長期臥床及雌激素水平下降均會引起硬化蛋白表達增加。雌激素不能單獨調節硬化蛋白表達,但可通過BMPs通路和Wnt/ERαWntt經典通路,改變RANKL/OPG比,影響硬化蛋白表達。除雌激素的間接作用外,GWASs研究表明,MEF2C可直接增加SOST表達。目前針對硬化蛋白的抗體已進入三期臨床試驗。一項多中心研究顯示,硬化蛋白抗體romosozumab顯著提高絕境后骨質疏松患者腰椎骨密度(較基線增加11.3%),并且這一效果優于阿倫唑奈和特立帕肽(較基線增加4.1%7.1%)。而血清骨形成標志物P1NP在短期內迅速增加,并伴隨骨吸收標志物水平下降。在試驗過程中未見嚴重用藥副作用。

    除硬化蛋白外,Wnt通路還受到分泌型卷曲蛋白相關蛋白(SFRP4)、阻黑蛋白(DKK1)、RSPO3調控。SFRP4Wnt蛋白結合、DKK1LRP5/6聚合體結合抑制Wnt通路的激活,而RSPO3可以拮抗DKK1的抑制作用。

    叉形頭轉錄因子家族(FOXO)參與細胞自我更新、增殖、生存等過程。生理條件下,FOXOsPI3K/Akt抑制,氧化應激狀態或生長因子缺失可引起FOXOs轉移至核內,使Wnt-βcatenin-TCF/LEF通路轉向Wnt-βcatenin-FOXO-PPARs。在細胞分化不同時期,FOXOs產生不同的生物學效應。在間充質干細胞階段,FOXO可上調RUNX2表達,促進分化,在成骨細胞前體細胞中,通過抑制Wnt通路抑制細胞增殖,在成熟成骨細胞中主要抑制氧化應激對細胞的損傷作用。

    細胞信號通路相互關聯構成網絡,在成骨細胞中,Wnt經典通路的靶基因之一Jag1編碼的JAG1NOTCH信號通路的重要配體,因而成為NOTCHWnt通路關聯的重要節點。而Wnt通路也受到其他信號通路的調節。Wnt通路活化過程中需要鈣通道的開放和PKC/ERK的參與,鈣通道蛋白需要在特定半胱氨酸位點發生巰基化才能發揮生物學作用,內源性硫化氫是巰基化必需的物質,雌激素通過上調胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚裂解酶(CSE)水平增加細胞內硫化氫水平,從而實現對Wnt通路的調控。

    二、BMP通路

    骨形態發生蛋白(BMP)是轉化生長因子β(TGF-β)超家族中的一員,通過經典的BMP/Smad通路和非經典MAPK通路影響RUNX2Osterix等轉錄因子的表達,從而達到調節骨代謝、細胞分化的作用。BMPs常以同源二聚體的形式存在并發揮效應,根據氨基酸和核苷酸相似性將BMPs分為4個亞族:BMP2/4,BMP9/10,BMP5/6/7/8,BMP12/13/14。目前已證實BMP2BMP7在促進骨愈合方面具有良好的安全性和有效性,并進入臨床使用,而BMP3BMP13被證實是骨生長的負性調節分子。BMPs受體屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體,分為1型受體(BMPRIA、BMPRIB、ACVRI)2型受體(BMPRII,ActrIIA ActRIIB),BMP配體在細胞外與2型受體結合,磷酸化1型受體激活下游R-Smads(Smad1,5,8),R-SmadsCo-Smads形成復合物轉位至細胞核內,啟動Runx2Osterix等靶基因轉錄,促進成骨分化。

    BMP-smad經典途徑外,BMP還可以通過BMPR1A可以募集Tab1-Tak1復合物,短時間內激活Tak1/2-Mek1/2-Erk1/2信號通路,調節P16INK4a等靶基因表達,影響成骨分化過程。這一途徑受酪氨酸激酶c-Abl調節。C-Abl通過磷酸化BMPR1A羧基端特定的酪氨酸殘基,促使BMPR1ABMPR2相互作用,激活BMP-smad通路。

    BMP通路的促成骨分化作用與組蛋白去甲基化有關。Ling 發現BMP4/7可通過Smad上調間充質干細胞中去甲基酶KDM4BKDM6B,這兩種去甲基酶通過移除H3K9m3H3K27m3、募集RNA聚合酶啟動DLXHOX的表達,進而啟動成骨分化相關的RUNX2SP7(OSX)的轉錄,同時增加BMP2、BMP4的表達,形成正反饋調節。

    雌激素可以通過調節BMP的表達影響BMP通路的信號傳遞,這一過程可能需要GATA4的參與。GATA家族是一類與DNA (A/T)GATA(A/G)序列結合的轉錄因子,GATA4被認為與成骨細胞分化相關,其表達受ERα調節,是雌激素調節TGFβ/BMP/Smads的關鍵因子。GATA4表達受雌激素信號通路調節,并協助雌激素受體與DNA結合,啟動或抑制靶分子如BMP4、BMP6、TGF/2/3、BMP受體的轉錄。

    三、RANKL通路

    NF-κB是參與免疫和細胞應答的重要轉錄因子。在哺乳動物中,NF-κB家族包括RelA (p65), RelB,c-Rel, 以及前體蛋白NF-κB1(p105)NF-κB2(p100),后兩種可被加工成p50 p52。經典途徑中,IKKβNEMO引起IκBα磷酸化和P65/P50異源二聚體向核內轉位。非經典途徑中NIKIKKα磷酸化P100,并將其加工為P52,釋放RelB/P52復合物。TNF家族如RANKL、TNF、淋巴毒素β、CD40L均可調節NF-κB通路。其中,RANKL可以通過腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)NIK分別參與NF-κB經典和非經典途徑的調控。

    既往針對TRAF家族的研究表明,TRAF2,5,6NF-κB途徑中起正性調節作用。TRAF3最早被認為對B細胞中NF-κB通路具有負性調控作用。在此基礎上,Yan發現,TRAF3同樣對破骨分化具有抑制作用,一方面TRAF3可以抑制NIK-IKKα通路,另一方面,可以上調NF-κB途徑負性調節分子1IFN的表達。而在NF-κB激活過程中,RelB作為轉錄因子可啟動自噬蛋白Beclin-1(BECN1基因編碼)的轉錄,通過自噬/溶酶體降解TRAF3。進一步研究發現,抗瘧藥氯喹可以保護TRAF3不受溶酶體降解,進而抑制破骨細胞分化,這為骨質疏松藥物的開發提供新的途徑。

     信號傳導及轉錄激活因子(STAT)家族廣泛參與破骨細胞分化過程,已證實,β干擾素和白介素4 通過STAT1、STAT6負性調節破骨細胞分化過程。據此,Jun Hirose提出破骨細胞存在負反饋調節機制,并在試驗中證實RANKL在介導破骨細胞分化的過程中會引起白介3表達增加,激活STAT5,上調Dusp12的表達,使MAPK通路去磷酸化,從而負性調節破骨分化過程。

     Riku認為骨代謝的動態平衡本質是成骨細胞分化,成骨細胞依賴的破骨細胞分化及破骨細胞分化三者的平衡。Ebf1Zfp521的相互作用調節這一平衡。在成骨細胞中,Zfp521可抑制RANKL的表達,而在破骨細胞中,Zfp521通過NuRDEbf1結合,抑制Ebf1靶基因Ccl9的表達,而Ccl9與其受體Ccr1可以加強RANKl通路的信號轉導。

    在破骨分化過程中,基因表觀調控同樣起重要作用,Keizo 發現,RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)可以引起單核巨噬細胞前體細胞(BMMs)向破骨細胞分化,在這一過程中,DNA從頭甲基化轉移酶(Dnmt)轉錄水平顯著增加。通過建立Dnmt3aDnmt3b敲除的胚胎干細胞模型,進一步證實,Dnmt3aCD11b陽性的破骨前體細胞向破骨細胞分化階段起主要作用?;蚪M存在特定基因如Irf8可以抑制破骨細胞分化,生理情況下RANKL作用與破骨細胞可引起Dnmt3a表達,并通過上調三羧酸循環增加ATP的合成,在甲硫氨酸腺苷轉移酶(Mat)作用下生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),Dnmt3a與甲基供體SAM共同引起Irf8 轉錄因子甲基化,抑制Irf8表達。Rajavelu發現植物多酚可以抑制DNA甲基化,這對骨質疏松藥物的研制具有借鑒意義。

    Wnt通路相似,RANKL-RANK通路也存在天然拮抗劑OPG,OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員,它最主要的生物學作用是抑制體內破骨細胞的分化、活化,并促進其發生凋亡,這一效應是通過競爭性與RANKL結合抑制RANKL通路的活化完成的。既往認為OPG由成骨細胞和骨細胞分泌調控骨轉化,但最近研究證實淋巴細胞是骨髓中主要的OPG來源。Luo提出,破骨細胞還存在RANKL的第二受體,即富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體4(LGR4),可以與RANK競爭性結合RANKL后激活GSK-3βGαq-鈣離子途徑抑制T細胞活化核因子1(NFATC1)的表達。

    四、NOTCH通路

    NOTCH是調節細胞生命進程的進化保守的信號受體,包括NOTCH1-4 4種亞型,分為胞外結構域,跨膜結構域和胞內結構域NICD,配體為JAG1,JAG2,Delta1,3,4,表達受Wnt等信號通路調控。重組信號結合蛋白jκ(RBPjκ)NOTCH通路下游重要的轉錄因子。NOTCH未激活狀態下,RBPjκ與轉錄抑制因子結合,阻止靶基因轉錄。NOTCH與配體結合后,受γ-分泌酶水解作用釋放NOTCH胞內段(NICD),NICD向核內轉移,與RBPjκ結合,使其與轉錄抑制因子解離,啟動靶基因Hes1,Hey1 等的表達。

    在成骨細胞中,NOTCH可以抑制間充質干細胞向成骨細胞分化,促進成骨細胞成熟,這一作用與HES蛋白對成骨細胞的吻合。既往研究顯示,Hes1轉基因小鼠表現為成骨不全,但在成熟成骨細胞中條件敲除Hes1可增加骨礦化。

    系統性慢性炎癥反應可引起骨量丟失,比如類風濕性關節炎患者常伴有明顯骨質疏松,這一現象與炎性因子對骨代謝的調節有關。已證實炎癥因子如IL1,6,TNFα可以誘導破骨細胞分化,除此以外,TNFα等還可以通過NOTCH影響成骨細胞分化。Zhang發現,P52/RELB可以與NICD結合,增強RBPjκ對靶基因轉錄的啟動作用,而TNFα可以上調NF-κB的表達。通過γ-分泌酶抑制劑阻斷NOTCH通路可以增加動物模型的骨密度,這為治療骨質疏松提供新靶點。

    五、雌激素信號通路

    雌激素是最主要的雌性激素,在生殖系統和非生殖系統中均具有重要作用,目前認為雌激素功能及水平的異常改變是帕金森病、阿爾茲海默癥、骨質疏松等年齡相關疾病的病因之一。雌激素受體分為核受體ERα、ERβ和膜受體GPR30ER-X。根據雌激素及其受體的效應機制將雌激素信號通路分為以下4類:

    1.雌激素受體依賴核啟動的信號途徑

    雌激素擴散進入細胞內,與細胞質及核內的ERα、β結合,使其形成同源或異源二聚體,通過其DNA結合區域(DBD)直接與靶基因啟動子上的雌激素應答元件(EREs)結合并募集輔助激活因子啟動靶基因轉錄。此外,激活的雌激素受體還可與轉錄因子如刺激蛋白SP-1、活化蛋白AP-1、NF-κB、c-jun結合,影響其轉錄活性。

    2.雌激素受體依賴膜啟動的信號途徑

    雌激素與細胞膜上的ERGPR30結合,可在數秒鐘內改變酪氨酸激酶受體、胰島素樣生長因子受體、神經突觸受體,繼而通過Ras/Raf/MEK/ERK、或PI3k/Akt/m-TOR改變靶基因轉錄因子活性。

    3.非雌激素受體依賴途徑

    雌激素的酚環結構可以抑制損傷線粒體釋放ROS,這一過程不需要雌激素受體的參與。此外,既往研究發現,在雌激素受體敲除的乳腺癌細胞中,雌激素仍可促進癌細胞增殖,提示雌激素可以不依賴雌激素受體發揮生物學效應。

    4.非配體依賴的ER激活

    ER可以被雌激素以外的多種細胞因子如神經遞質,表皮生長因子,胰島素樣生長因子激活,并可以被多種細胞內信號通路激活劑如MAPK,PKA,PKC等,這種激活過程有賴于ER的磷酸化。比如EGF磷酸化ERα AF-1Ser118,PKA磷酸化DBDSer236,激活其轉錄活性。

     雌激素具有抑制高水平骨轉化的作用,這一過程與ERα有關。ERα缺失的小鼠往往呈現出明顯骨量丟失,通過基因編輯證實雌激素可以通過ERE影響骨轉化過程,但Windahl發現,過表達ERE并未顯著改變機械負荷引起的成骨分化的改變,而ERα缺失或AF-1區域的失活可以導致成骨分化障礙,這表明雌激素可通過多種途徑而非單純影響ERE來發揮骨保護作用。

     骨是一個持續處于動態變化的器官,骨代謝的平衡有賴于骨形成與骨吸收的協調統一,這一過程不僅需要細胞內多條信號通路的交聯,更需要細胞間的信息交流。IGF-1TGFβ是公認的協調骨吸收與骨形成的信號分子,近來研究發現,骨形成過程中破骨細胞前體細胞分泌PDGF-BB可以促進內皮細胞遷移和增殖,促進血管形成和骨發生。免疫系統在骨代謝中的作用也越來越被重視,B細胞和T細胞合成的IL17、IL1、IL6、TNFα可以上調RANK的表達,而Th17細胞可直接參與破骨細胞分化。信號素家族的分泌型蛋白在骨代謝中發揮多重作用,sema4dCD14+的單核細胞表面受體CD72結合可促進IL1等炎性因子的分泌,而sema3a一方面可以強化成骨細胞Wnt經典通路,另一方面可與Neuropilin1結合,破壞plexin2與髓細胞表達觸發受體-2(TREM)DNAX激活蛋白12(DAP12)的聚集,抑制免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的磷酸化,從而抑制ITAM信號通路介導的破骨分化。此外,骨髓中的脂肪細胞也參與構成骨代謝微環境。脂肪細胞和成骨細胞均由間充質干細胞分化產生,生理條件下處于此消彼長的動態平衡,PPARs參與調控體內脂質和能量代謝,并且不同的亞型具有不同的生理效應,研究證實PPARγ可以抑制Wnt經典途徑,促進成脂分化,PPARβ/δ可以強化Wnt通路,調整RANKL/OPG比,恢復骨轉化平衡。衰老、氧化應激、雌激素缺乏、服用糖皮質激素等可以激活Wnt-FOXO-PPARγ通路,使成骨分化向成脂分化轉變,使骨組織中脂肪增加而骨形成減弱。同時脂肪細胞合成的瘦素可以抑制骨形成,導致骨質疏松的發生。

    長久以來,骨質疏松癥由于其較高的發病率和死亡率已成為嚴重的公共衛生問題,據統計,在50歲以上的人群中,有1/3的女性和1/5的男性存在骨質疏松,而其中有20%左右的老年患者會因股骨頸骨折死亡。自1995年阿倫唑奈投入使用,數十年來已有多種不同藥理機制的藥物應用于骨質疏松的預防和治療。隨著骨代謝相關通路研究的深入,抗骨質疏松藥物的研發也越來越具有針對性,從最初阿倫唑奈及特立帕肽的經驗性用藥到2010年第一次針對RANKL通路研發狄諾塞麥,對骨質疏松發病機制的研究為治療提供了潛在的藥物作用靶點,為治療骨質疏松以及類風濕性關節炎、促進骨折愈合提供新的可能。

     (來源:中國骨質疏松雜志,龐新崗)

     

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